Muitas vezes, uma variedade de meningites e encefalites assépticas deixava de ter um diagnóstico etiológico, pela ausência de um padrão ouro adequado. A biópsia cerebral é ainda considerada o padrão ouro no diagnóstico das encefalites virais, mas é pouco utilizada pela sua natureza invasiva. O isolamento viral do líquido cefalorraquidiano (LCR) em cultura celular tem se mostrado ineficiente para a maioria das meningites e encefalites virais, por ser um método muito lento e pouco sensível. Normalmente, os achados laboratoriais são pouco elucidativos, e os testes sorológicos específicos disponíveis oferecem um diagnóstico retrospectivo, e não adequado para pacientes imunocomprometidos.
A emergência do vírus da imunodeficiência humana (HIV) aumentou a necessidade de testes laboratoriais mais sensíveis, mais rápidos e menos invasivos para diagnosticar as consequências secundárias desta patologia: as infecções oportunistas. Estes processos infecciosos podem ser provocados pelo próprio HIV ou por uma série de agentes oportunistas tais como: Toxoplasma gondii, vírus JC, citomegalovírus, vírus da varicela zoster, vírus do Herpes simples, vírus do Epstein-Barr, micobactérias, vírus do herpes humano tipo 6, além de alguns fungos e bactérias. Estas síndromes apresentam-se com sinais e sintomas inespecíficos, podendo ocorrer múltiplos processos patológicos no SNC de um mesmo paciente, assim, se tornando quase impraticável o diagnóstico clínico. Com o advento dos quimioterápicos específicos, uma identificação acurada e precoce do agente causal da infecção se faz necessária para um melhor manejo do paciente, além de permitir ações de saúde pública, quando indicado. No contexto destas limitações, testes de amplificação de ácidos nucléicos, em especial de PCR, têm sido exaustivamente avaliados no diagnóstico das infecções virais, principalmente em pacientes com SIDA.
Aplicações Clínicas
A PCR tem sido amplamente utilizada nas mais diferentes áreas da pesquisa biológica, entretanto, o maior impacto tem sido no diagnóstico das doenças infecciosas, principalmente naquelas causadas por microrganismos não cultiváveis, com crescimento lento, ou que exigem meios de cultura altamente especializados como vírus, determinadas bactérias, fungos e protozoários. A PCR possibilita a análise de um maior número de patógenos de maneira mais rápida e precisa (Eisenstein, 1990).
Os métodos moleculares são rápidos e sensíveis para a detecção viral, e em algumas etiologias, já estão sendo considerados os testes de escolha, como na encefalite herpética, onde a biópsia cerebral foi suplantada pela PCR (Lakeman, 1995). O emprego de técnicas de neuroimagem, em combinação com a PCR, pode descartar a biópsia cerebral em algumas situações de doenças focais do SNC (Skiest, 2002).
Pacientes sob imunossupressão, tais como transplantados de fígado, rim e medula e pacientes oncológicos, também se beneficiam do diagnóstico molecular, pois a utilização de testes sorológicos possui aplicação limitada, já que a produção de anticorpos contra antígenos não é eficiente.
Recém nascidos apresentam anticorpos do tipo IgG maternos transferidos passivamente durante a gestação. Assim, técnicas sorológicas que pesquisam anticorpos IgG não são adequadas e a pesquisa de anticopos do tipo IgM, em muitos casos, não é elucidativa para o diagnóstico das infecções neonatais. A detecção do DNA do agente infeccioso tem sido empregada nestes casos, tanto no sangue periférico, quanto na urina e no líquor da criança. A PCR também tem diagnosticado casos de infecções intra-uterinas através da amplificação do DNA patogênico no líquido amniótico.
A utilização da PCR no diagnóstico microbiológico, além de amplificar o DNA do agente causal da infecção, diretamente da amostra, oferece a possibilidade de tipar o microrganismo, fornecer dados sobre a patogênese, epidemiologia e tratamento da doença. Pode-se ainda monitorar o tratamento pela quantificação do patógeno e detectar mutações que conferem resistência às drogas, por amplificar sequências distintas do genoma (Louie, 2000).
Método
A PCR empregada no diagnóstico das doenças infecciosas no CDG é a nested PCR ou PCR dupla qualitativa (método próprio), e foi validada clínica e laboratorialmente com diversos estudos (Chesky, 1998; Chesky, 2000; Peres, Burin, 2004; 2005; Failace, 2005; Miura, 2006; Teló, 2007; Coser, 2008; Chesky, 2009). A PCR dupla emprega dois pares de iniciadores diferentes, um par em cada reação e o produto da primeira reação serve de amostra para a segunda, conferindo maior sensibilidade e especificidade ao exame. O método de detecção dos fragmentos amplificados da PCR usa eletroforese em gel de agarose com brometo de etídio e visualização em transiluminador com luz UV. Os produtos formados são comparados com controles positivos ou marcador de peso molecular e os resultados reportados como detectável (presença de DNA) e indetectável (ausência de DNA).
Figura 1: Gel de agarose com brometo de etídio: 1, 2 e 3
Bandas de DNA de tamanhos diferentes e marcador de PM.
